1. Enzim
sebagai Materi
Enzim adalah salah
satu komponen dalam makhluk hidup yang berperan penting dalam menjalankan dan
mengatur perubahan kimia dalam suatu sistem biologi. Enzim dihasilkan oleh
organ-organ makhluk hidup dan terdapat di dalam bagian sel. Suatu enzim
tersusun dari protein karena memiliki sifat-sifat seperti protein, yaitu
sensitif terhadap suhu (thermolabil), serta membutuhkan kondisi pH yang sesuai.
Enzim memiliki sifat yang khas sebagai katalis, yang sangat menentukan kerja
suatu sel. Enzim bekerja secara reversibel atau bolak-balik. Serta bekerja secara
spesifik pada satu substrat.
Enzim secara umum
diklasifikasikan dalam enam kelas. Yaitu :
a.
Oksidoreduktase
b.
Transferase
c.
Hidrolase
d.
Liase
e.
Isomerase
f.
Ligase
Enzim yang termasuk
dalam kelas isomerase bekerja pada reaksi pemindahan satu gugus fungsi di dalam
suatu molekul membentuk isomer. Enzim isomerase diklasifikasikan lebih spesifik
menurut jenis reaksinya. Antara lain :
1.
Rasemisasi atau epimerisasi
2.
Isomerisasi cis-trans
3.
Oksidoreduktase intramolekul
4.
Reaksi transfer intramolekul
Tata nama Alanin
rasemase menurut Commision on Enzymes of
The International Union of Biochemistry berdasarkan fungsinya, yaitu
EC 5.-.-.-
Isomerase
EC 5.1.-.- Rasemase dan Epimerase
EC 5.1.1.- berperan dalam asam
amino dan turunannya
EC 5.1.1.1 Alanin
rasemase
Alanin rasemase
terdapat pada beberapa jenis bakteri dan terletak di dinding sel bakteri
(peptidoglikan) yang berfungsi untuk mengkatalis interkonvensi L- menjadi D-
alanin. Gugus kofaktor ( gugus bukan protein yang terikat pada enzim) pada
alanin rasemase adalah gugus pyridoxal 5’-fosfat (PLP). Pada sisi aktif enzim
terdapat asam amino Tyrosin (265) dan asam amino Lysin (39). Inhibitor pada
enzim ini adalah alanin fosfonat dan D-cycloserine. Alanin fosfonat merupakan
inhibitor bersaing karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat
(D-alanin) dan dapat membentuk kompleks dengan enzim. Inhibitor D-cycloserine
berikatan dengan enzim atau pada enzim yang telah mengikat substrat, sehingga
menghambat reaksi enzim.
Alanin rasemase membentuk homodimer yang mana
monomer membentuk asosiasi pada kepala hingga ekor yang terlihat khas pada
alanin rasemase. Masing – masing monomer memiliki delapan domain α-stranded /β
barel (residu 1-238) dan domain β-untai yang diperpanjang (residu 239-367).
Pada satu monomer L-alanin berada pada letak yang berdekatan dengan
monomer domain β-untai . meskipun kedua
monomer memiliki lipatan yang sangat morip namun kedua monomer ini memiliki
bentuk kristal yang berbeda dan simetri kristal yang tidak dgunakan dalam
penyempurnaan. Perbedaan antara Cα dari kedua monomer setelah mengalami super
posisi yaitu memiliki panjang gelombang 0,38Å, dan A dan B
masing-masing memilki faktor 38,4 dan 46,9A2.
Pada alanin rasemase
pyridoxal-5-fosfat terhubung ke lysin 39 melalui ikatan aldimine internal yang
berada di dalam barel domain α/β. Seperti yang ditunjukkan pada gambar dibawah
ini:
Enzim alanin rasemase bekerja secara optimum pada
suhu 230-370 Celcius. Sedangkan pada pH ±7.0
enzim ini dapat bekerja secara optimal. Pada suhu yang rendah mendekati titik
beku enzim tidak akan rusak namun enzim alann rasemase tidak aktif (inactive).
Namun dengan adanya kenaikan suhu lingkungan, enzim mulai bekerja dan mencapai
suhu maksimum pada suhu tertentu yaitu 230-370 Celcius
enzim alanin rasemase akan bekerja optimum. Apabila suhu ditingkatkan
terus,jumlah enzim yang aktif akan berkurang karena terjadi denaturasi.
Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncak pada suhu optimum.
Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu. Kecepatan
reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada pH maksimum. Pada alanin rasemase
bekerja maksimum pada pH ±8,3. Apabila pH lebih dari ±8,3 enzim alanin
rasemase akan mengalami denaturasi. Selain itu pada keadaan ini baik enzim
maupun substrat akan mengalami kenaikan
muatan listrik yang mengakibatkan enzim tidak dapat berikatan dengan substrat
yaitu L-Alanin. Pada pH maksimum ±8,3 alanin rasemase akan mengambil struktur 3
dimensi yang sangat tepat sehingga ia dapat mengikta dan mengelolah substrat
dengan kecepatan yang setinggi-tingginya. Di luar pH maksimum alanin rasemase
struktur 3 dimensi ini akan mulai berubah sehingga substrat tidak dapat lagi
berikatan tepat di bagian molekul enzim yang mengelola substrat. Akibatnya
proses katalitik tidak akan berjalan dengan optimum. Oleh karena itu struktur 3
dimensi berubah akibat pH yang tidak optimum. Berikut adalah struktur susbtrat D-alanin dan produk
L-alanin serta kofaktor PLP (pyridoxal 5’-fosfat).
2. Enzim
sebagai Katalis
Salah
satu fungsi enzim yaitu sebagai katalisator, yang mana enzim berperan
mempercepat reaksi tanpa ikut larut dalam reaksi namun dihasilkan kembali
sebagai produk. Alanin rasemase merupakan enzim penting dalam bakteri. Alanin
rasemase (Alar) mengkatalisis interkonvensi antara L-Ala dan D-Ala dengan
bantuan kofaktor pyridoxal 5’-fosfat (PLP). Nitrogen piridin di PLP tidak
terprotonasi karena berinteraksi dengan Arg219 pada sisi aktif D-alanin. Dengan
gabungan mekanika kuantum dan mekanika molekul yang dapat mengetahui
peningkatan keasaman karbon dalam reaksi rasemisasi alanin dikatalisis oleh
alanin rasemase. Gabungan dari mekanika kuantum dan mekanika molekul ini
menunjukkan bahwa peningkatan keasaman karbon α-asam amino oleh pyridoxal
kofaktor 5’-fosfat (PLP) dan piridin, tidak terprotonasi karena adanya efek
solvasi, berbeda dengan stabilitas intrisik elektron menarik ion piridinium
untuk membentuk intermediet quinonoid. Kemudian alanin rasemase menurunkan
keasaman α-proton dan menyediakan 14-17 kkal/mol untuk stabilitas transisi.
Efek
dari kofaktor pyridoxal 5’-fosfat (PLP) pada aktivitas dan stabilitas alanin
rasemase, memiliki aktivitas katalitik yang tinggi pada suhu rendah namun pada psychosaccharolyticus Bacillus
aktivitas yang tinggi terletak pada suhu tinggi. Penurunan aktivitas enzim pada
suhu inkubasi yaitu lebih dari 40°C adalah konsisiten pada penurunan jumlah PLP
yang terikat. Pada PLP 0,125 mM, aktivitas spesifik enzim psychorophilic lebih tinggi dari alanin rasemase termofilik, yang mana memiliki aktivitas
katalitik yang tinggi pada suhu yang tinggi dari stearothermophilus Bacillus bahkan pada 60°C.
3. Mekanisme
Reaksi
Mekanisme reaksi
alanin rasemase menggunakan dua katalis basa pada sisi aktif Tyrosin (265) dan
PLP- Lysin (39). Lysin (39) yang terikat pada kofaktor berperan sebagai residu
katalis yang meringkas atau mengurangi a-hidrogen dari L-alanin dan menambah a-hidrogen dalam gugus intermediet membentuk D-alanin.
Substrat yang memiliki gugus karboksil turut berperan dalam katalisis sebagai
media dalam transfer proton antara dua katalis basa. Reaksi
melibatkan tiga langkah berurutan: (i) pembentukan intermediate tetrahedral
dengan situs lisin aktif dan substrat amino terikat pada kofaktor PLP; (ii )
transfer proton tidak langsung antara
substrat amino dan residu lisin, dan (iii) pembentukan aldimine eksternal
Aldimine adalah
imina yang terbentuk dari amina dan aldehid. Adisi nukleofil dari amina ke
gugus karbonil yang diikuti dehidrasi. Mekanisme dimulai dengan protonasi
oksigen karbonil yang menyebabkan karbon karbonil menjadi elektrofil yang baik.
Selanjutnya amina menyerang karbon karbonil, kemudian proton ditransfer ke
oksigen . Pasangan nitrogen tunggal kemudian membentuk ikatan pi dengan karbon
dan memindahkan air dengan eliminasi, meninggalkan nitrogen bermuatan positif
yang diprotonasi oleh basa.
4. Kinetika
Reaksi Enzim
Mekanisme reaksi enzimatik
untuk sebuah subtrat tunggal. Enzim (E) mengikat substrat (S) dan menghasilkan
produk (P).
Kinetika
enzim menginvestigasi bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya
menjadi produk. Sifat kinetik AlrSP
pada rasemase alanine bakteri dari L-alanin dan D-alanin dapat diketahui. Nilai
Km untuk L-alanin adalah 1,9 mM. Nilai Km disini adalah konstanta
Michaelis-Menten yang merupakan konsentrasi substrat yang diperlukan
oleh suatu enzim untuk mencapai setengah kelajuan maksimumnya. Serta memiliki nilai Vmax untuk rasemisasi
L-alanin menjadi D-alanin adalah 84,6 U/mg, Nilai Vmax disini menunjukkan semua
sisi aktif enzim akan
berikatan dengan substrat, dan jumlah kompleks ES adalah sama dengan jumlah
total enzim yang ada, dimana dalam
hal ini satu unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis
racemization dari 1 ìmol substrat per menit.
Pada kinetika ini,kofaktor yang berperan adalah
PLP dan inhibitor yang berperan adalah D-cyclocerin. D-cycloserin akan
berikatan dengan enzim atau substrat enzim. D-cyclocerin merupakan inhibitor
non-kompetitif karena dapat emengubah konformasi enzim-substrat, dan
mengakibatkan sisi katalitik enzim-substrat menjadi inaktif. Hal ini berarti
bahwa kompleks enzim-substrat tidak dapat menghasilkan reaksi yang diharapkan.
Rasemase
alanin oleh alanin rasemase melibatkan 2 reaksi abstraksi proton pada R-amino
karbon oleh kedua basa lemah,yakni residu Tyr yang mengalami unprotonasi dalam
ketika konversi L-ke-D alanin, dan residu Lys netral dalam L-D untuk
isomerisasi. Dalam larutan berair, pKa keasaman karbon untuk asam amino
zwitterionic seperti Gly adalah 28.9,61 sedangkan pKa untuk ion fenol dan
etilamonium, mewakili sisi rantai Tyr dan Lys, adalah 10.062 dan 10.863. Berikut
ini adalah tabel dan grafik dari energi bebas pada
reaksi enzim alanin rasemase.
Abstraksi proton dengan ion phenolate dapat dianggap sebagai reaksi model dalam air untuk reaksi enzimatik yang sesuai untuk
konversi L-ke D-alanine. Afinitas proton eksperimental tersedia untuk ion phenolate
64 dan untuk EtNH2 65 masing-masing 350,5 dan 219,9 kkal / mol dan memberikan
validasi dari metode yang digunakan dalam perhitungan. Untuk deprotonasi uncatalisis dari alanin oleh
phenolate ion dalam air, diperoleh energi bebas dari
30,9 kkal /
mol menggunakan potensial SRP-AM1, yaitu sekitar 5
kkal / mol
lebih besar dari nilai eksperimen
ditentukan (25,8 kkal / mol) berdasarkan pKa
nilai untuk glisin dan fenol. Harga pKa untuk
Ala, berdasarkan PMF
dan nilai eksperimental untuk fenol, adalah 32,7 sebanding dengan nilai 28,9 untuk
Gly.61 Reaksi energi
bebas dari Ala-PLP (H +) tanpa
protonasi pada nitrogen piridin dari PLP yang merupakan kofaktor, diperoleh
energi bebas abstraksi proton sebesar 12,7 kkal / mol, dengan pKa prediksi 19,3
untuk R-amino karbon di Ala-PLP. Pada fase gas bebas (energi bebas) dasar terkonjugasi dari Ala-PLP
(H +) secara signifikan lebih kecil daripada alanin zwitterion. Sehingga,
pembentukan piridin akan terprotonasi oleh spesies aldimin. Ala-PLP (H +), dapat
meningkatkan keasaman R-amino dengan nilai -65 kkal / mol. Namun, pembentukan Ala-PLP
memiliki efek sebaliknya, dapat mengurangi keasaman karbon sebesar 36 kkal /
mol. Ala- PLP dan PLP (H +) dengan solvasi air, menghasilkan pKa dari 19,3(Ala-PLP (H +) ke 11,0 (Ala-PLP) . Dalam enzim alanin racemase, pasangan
ion dan hydrogenbonding yang berinteraksi dengan residu di sisi aktif lebih
menstabilkan dasar terkonjugasi dari aldimine eksternal Ala-PLP yang akan berenergi sekitar 6 kkal / mol
relatif terhadap proses berair. Menggunakan pKa (7.3) dari Tyr265 di Alar, yang lebih kecil dari pKa fenol
dalam air (10,0), dapat dketahui juga pKa dari Ala- PLP adalah 12,2 dalam sisi
aktif dari racemase alanin. Energi bebas
keseluruhan reaksi konversi dari L-ke D-alanin adalah -2.8 kkal / mol.
a. Pengaruh
suhu terhadap kinetika enzim alanin rasemase
Enzim alanin rasemase bekerja secara optimum pada suhu 230-370
Celcius. Pada suhu optimum ektivitas dari enzim alanin
rasemase mencapai nilai tertinggi, sehingga pada posisi inilah kecepatan reaksi
mencapai posisi maksimal. Pada suhu yang rendah mendekati titik beku
enzim tidak akan rusak namun enzim alanin
rasemase tidak aktif (inactive). Namun dengan adanya kenaikan suhu lingkungan,
enzim mulai bekerja dan mencapai suhu maksimum pada suhu tertentu yaitu 230-370
Celcius enzim alanin rasemase akan bekerja optimum. Apabila suhu ditingkatkan
terus,jumlah enzim yang aktif akan berkurang karena terjadi denaturasi.
Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncak pada suhu optimum.
b. Pengaruh
pH terhadap kinetika enzim alanin rasemase
Enzim alanin rasemase
bekerja pada pH optimum ±8.3 Pada pH kurang
dari ±8.3 sisi aktif enzim rasemase mengalami denaturasi secara
perlahan sehingga aktivitasnya menurun. Dengan menurunnya aktivitas enzim rasemase,
kecepatan reaksi akan menurun. pH optimum enzim alanin rasemase yaitu sekitar ±8.3 sehingga pada pH ini aktivitas enzim rasemase tinggi.
Jika aktivitas enzimnya tinggi maka kecepatan reaksi akan tinggi pula.
Pada pH maksimum ±8,3 alanin rasemase akan mengambil struktur 3
dimensi yang sangat tepat sehingga ia dapat mengikat dan mengelolah substrat dengan kecepatan yang
setinggi-tingginya. Di luar pH maksimum alanin rasemase struktur 3 dimensi ini
akan mulai berubah sehingga substrat tidak dapat lagi berikatan tepat di bagian
molekul enzim yang mengelola substrat. Akibatnya proses katalitik tidak akan
berjalan dengan optimum. Oleh karena itu struktur 3 dimensi berubah akibat pH
yang tidak optimum.
c. Pengaruh
inhibitor terhadap kinetika enzim
Inhibitor merupakan faktor
penghambat kerja enzim. Ada beberapa jenis inhibitor yang dibedakan menurut
cara kerja menghambat kerja enzim. Setiap enzim pasti memiliki inhibitor dan
masing – masing enzim memiliki inhibitor yang bereda – beda. Menurut kelompok
kami, inhibitor D-cycloserine akan berikatan dengan kompleks
enzim-substrat membentuk Enzim
substrat-inhibitor. Adanya inhibitor akan mengurangi kereaktifan reaksi,
sehingga mengganggu hasil reaksi yang diharapkan.
